Princip
Sekvenováním zjistíme pořadí bazí (A,C,T,G) v konkrétním úseku DNA. Postup můžeme rozdělit do několika kroků:
1. PCR. Pomocí dvojice primerů amplifikujeme vybraný úsek DNA. Primery jsou specifické pro jedno konkrétní místo v jaderné nebo chloroplastové DNA. V jaderné (nukleární DNA, nDNA) se nejjednodušeji a nejčastěji sekvenují oblasti tzv. internal transcribed spaceru (ITS), které jsou přítomny až v desítkách tisíc kopií. Úseky chloroplastového genomu se také velmi jednoduše amplifikují, protože kruhových molekul cpDNA je v izolátu zpravidla velké množství. Často se sekvenují nekódující úseky (introny nebo spacery) jako např. trnL-trnF, psbA-trnH atd.
2. Přečištění (purifikace) PCR produktu. Zbylé primery a neinkorporované nukleotidy (dNTP) odstraníme pomocí komerčního kitu. To je velmi důležité, protože při následné sekvenační reakci je použit pouze jeden primer a také koncentrace dNTP musí být vybalancována vzhledem k ostatním složkám, především fluorescenčně značeným nukleotidům (ddNTP).
3. Cyklické sekvenování (cycle sequencing). Modifikovaná PCR reakce, při které použijeme pouze jeden sekvenační primer a PCR produkt jako templát. Nedochází tedy k exponenciální, ale pouze k lineární amplifikaci templátu. Kromě klasických dNTP jsou v sekvenační směsi přítomny i ddNTP (2´,3´-dideoxynukleotidtrisfosfáty). Ty jsou fluorescenčně značeny (každá baze jinou barvou) a při inkorporaci do vznikajícího řetězce DNA zamezí jeho dalšímu prodlužování. Výsledkem sekvenační reakce je tak směs různě dlouhých řetězců DNA a každý je fluorescenčně označen barvou podle toho, kterou bazí končí. Tyto produkty jsou pak elektroforeticky rozděleny na automatickém sekvenátoru a je možno přečíst posloupnost jednotlivých bazí. Sekvenuje se vždy jen s jedním primerem. Sekvenátor umožní číst cca 700 bazí, záleží na kvalitě PCR produktu a na sekvenci bazí. Pokud chceme sekvenovat delší úsek než cca 700 bazí, je třeba provést dvě sekvenační reakce s různými primery, s tzv. forward a reverse primerem. PCR produkt bude osekvenován z obou stran. Získané sekvence se potom spojí dohromady pomocí speciálního programu.
4. Purifikace produktů sekvenační reakce. Před analýzou na automatickém sekvenátoru je třeba produkty cyklického sekvenování přečistit, např. na Sephadexu.
5. Sekvenační analýza na automatickém sekvenátoru. V kapilárním sekvenátoru ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems jsou produkty cyklického sekvenování elektroforeticky rozděleny podle délky.
Protokol na PCR amplifikaci
Viz obecný protokol k PCR.
Přečištění PCR produktu pomocí JETquick kitu (GENOMED)
PCR produkt přečistíme pomocí kitu GENOMED Jetquick PCR Purification Spin Kit, který využívá tzv. „spin column technique“, tj. kolonky s membránou, na kterou se váže DNA. Alternativou je QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit, případně můžeme přečistit fragment vyřízlý z gelu pomocí QIAquick Gel Extraction Kit.
Obecné
- Před započetím práce zkontrolujeme přidání ethanolu do pufru H2 (zaškrtnutí políčka na lahvičce).
- Do 1,5 ml eppendorfky odpipetujeme potřebný objem elučního pufru a předehřejeme na 60–70°C. v termobloku. Předehřátí pufru je důležité v případě eluce PCR produktu delšího než 5 kb.
Postup
- Ke zbylým 20 µl PCR produktu přidáme 80 µl roztoku H1 a důkladně promícháme na vortexu.
Pozn.:V případě jiného objemu PCR reakce přepočteme množství H1 roztoku, aby zůstal poměr zachován.
- Vložíme kolonku do označené 2 ml eppendorfky bez víčka (z kitu), přepipetujeme do ní směs z předchozího bodu.
- Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.
- Odstraníme filtrát (to, co proteklo kolonkou), DNA zůstala vázána na membráně.
- Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a přidáme 500 µl roztoku H2.
- Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.
- Opět odstraníme filtrát (DNA vázaná na membráně je promyta).
- Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách (13 800 rpm), abychom důkladně odstranili roztok H2 z kolonky.
- Vložíme kolonku do nové (a označené!) 1,5 ml eppendorfky (není součástí kitu) a přímo těsně nad střed membrány pipetujeme 30–75 µl TE pufru (příp. sterilní vody) předehřátého na 60–70°C.
- 5 min inkubujeme na stole
- Centrifugujeme 2 min při 13 000 rpm (DNA je eluována).
- DNA dále skladujeme při –20 °C .
Příprava vzorků pro sekvenování DNA
- Pro optimální průběh sekvenační reakce je potřeba zvolit správný poměr koncentrace primeru ku PCR produktu.
- Změříme koncentraci DNA pomocí spektrofotometru Biowave II
- Pracujeme na ledu a v Biohazard boxu
- Do 0,2 ml eppendorfek určených pro sekvenaci pipetujeme přečištěnou DNA v množství dle délky PCR produktu (viz tabulka), 3–5 pmol primeru a sterilní vodu do celkového objemu 15 µl.
| Templát | Množství | |
|---|---|---|
| Kit 3.1 | Kit 1.1 | |
| PCR produkty | ||
| 100–200 bp | 1–3 ng | 1–3 ng |
| 200–500 bp | 3–10 ng | 3–10 ng |
| 500–1000 bp | 5–20 ng | 5–20 ng |
| 1000–2000 bp | 10–40 ng | 10–40 ng |
| >2000 bp | 20–50 ng | 40–100 ng |
| ssDNA | 25–50 ng | 50–100 ng |
| dsDNA | 150–300 ng | 200–500 ng |
- Množství templátové DNA závisí na naměřené koncentraci (pro každý vzorek podle koncentrace PCR produktu spočítáme kolik µl je potřeba, aby v reakci bylo přítomno např. 20 ng DNA a podle toho upravíme množství vody pro příslušný vzorek).
- Poklepem na eppendorfku prsty promícháme a krátce stočíme na stolní centrifuze a odneseme do sekvenčního centra v přízemí UMBR AV ČR, kde provedou cyklické sekvenování, přečištění sekvenční reakce a také sekvenční analýzu v 16 –ti kapilárním sekvenátoru.
- Sekvenční centrum používá 2 sekvenační kity. Standardně používáme k sekvenaci 3.1 Cycle Sequencing Kit. 1.1 Cycle Sequencing Kit je lepší použít pokud je pro nás důležitý počátek sekvence studovaného úseku.