Sekvenování DNA

Princip

Sekvenováním zjistíme pořadí bazí (A,C,T,G) v konkrétním úseku DNA. Postup můžeme rozdělit do několika kroků:

1. PCR. Pomocí dvojice primerů amplifikujeme vybraný úsek DNA. Primery jsou specifické pro jedno konkrétní místo v jaderné nebo chloroplastové DNA. V jaderné (nukleární DNA, nDNA) se nejjednodušeji a nejčastěji sekvenují oblasti tzv. internal transcribed spaceru (ITS), které jsou přítomny až v desítkách tisíc kopií. Úseky chloroplastového genomu se také velmi jednoduše amplifikují, protože kruhových molekul cpDNA je v izolátu zpravidla velké množství. Často se sekvenují nekódující úseky (introny nebo spacery) jako např. trnL-trnF, psbA-trnH atd.

2. Přečištění (purifikace) PCR produktu. Zbylé primery a neinkorporované nukleotidy (dNTP) odstraníme pomocí komerčního kitu. To je velmi důležité, protože při následné sekvenační reakci je použit pouze jeden primer a také koncentrace dNTP musí být vybalancována vzhledem k ostatním složkám, především fluorescenčně značeným nukleotidům (ddNTP).

3. Cyklické sekvenování (cycle sequencing). Modifikovaná PCR reakce, při které použijeme pouze jeden sekvenační primer a PCR produkt jako templát. Nedochází tedy k exponenciální, ale pouze k lineární amplifikaci templátu. Kromě klasických dNTP jsou v sekvenační směsi přítomny i ddNTP (2´,3´-dideoxynukleotidtrisfosfáty). Ty jsou fluorescenčně značeny (každá baze jinou barvou) a při inkorporaci do vznikajícího řetězce DNA zamezí jeho dalšímu prodlužování. Výsledkem sekvenační reakce je tak směs různě dlouhých řetězců DNA a každý je fluorescenčně označen barvou podle toho, kterou bazí končí. Tyto produkty jsou pak elektroforeticky rozděleny na automatickém sekvenátoru a je možno přečíst posloupnost jednotlivých bazí. Sekvenuje se vždy jen s jedním primerem. Sekvenátor umožní číst cca 700 bazí, záleží na kvalitě PCR produktu a na sekvenci bazí. Pokud chceme sekvenovat delší úsek než cca 700 bazí, je třeba provést dvě sekvenační reakce s různými primery, s tzv. forward a reverse primerem. PCR produkt bude osekvenován z obou stran. Získané sekvence se potom spojí dohromady pomocí speciálního programu.

4. Purifikace produktů sekvenační reakce. Před analýzou na automatickém sekvenátoru je třeba produkty cyklického sekvenování přečistit, např. na Sephadexu.

5. Sekvenační analýza na automatickém sekvenátoru. V kapilárním sekvenátoru ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems jsou produkty cyklického sekvenování elektroforeticky rozděleny podle délky.

Protokol na PCR amplifikaci

Viz obecný protokol k PCR.

Přečištění PCR produktu pomocí JETquick kitu (GENOMED)

PCR produkt přečistíme pomocí kitu GENOMED Jetquick PCR Purification Spin Kit, který využívá tzv. „spin column technique“, tj. kolonky s membránou, na kterou se váže DNA. Alternativou je QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit, případně můžeme přečistit fragment vyřízlý z gelu pomocí QIAquick Gel Extraction Kit.

Obecné

  • Před započetím práce zkontrolujeme přidání ethanolu do pufru H2 (zaškrtnutí políčka na lahvičce).
  • Do 1,5 ml eppendorfky odpipetujeme potřebný objem elučního pufru a předehřejeme na 60–70°C. v termobloku. Předehřátí pufru je důležité v případě eluce PCR produktu delšího než 5 kb.

Postup

    • Ke zbylým 20 µl PCR produktu přidáme 80 µl roztoku H1 a důkladně promícháme na vortexu.

Pozn.:V případě jiného objemu PCR reakce přepočteme množství H1 roztoku, aby zůstal poměr zachován.

  • Vložíme kolonku do označené 2 ml eppendorfky bez víčka (z kitu), přepipetujeme do ní směs z předchozího bodu.
  • Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.
  • Odstraníme filtrát (to, co proteklo kolonkou), DNA zůstala vázána na membráně.
  • Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a přidáme 500 µl roztoku H2.
  • Centrifugujeme 1 minutu při 13 000 rpm.
  • Opět odstraníme filtrát (DNA vázaná na membráně je promyta).
  • Vložíme kolonku zpět do 2 ml eppendorfky a centrifugujeme 1 minutu při maximálních otáčkách (13 800 rpm), abychom důkladně odstranili roztok H2 z kolonky.
  • Vložíme kolonku do nové (a označené!) 1,5 ml eppendorfky (není součástí kitu) a přímo těsně nad střed membrány pipetujeme 30–75 µl TE pufru (příp. sterilní vody) předehřátého na 60–70°C.
  • 5 min inkubujeme na stole
  • Centrifugujeme 2 min při 13 000 rpm (DNA je eluována).
  • DNA dále skladujeme při –20 °C .

Příprava vzorků pro sekvenování DNA

  • Pro optimální průběh sekvenační reakce je potřeba zvolit správný poměr koncentrace primeru ku PCR produktu.
  • Změříme koncentraci DNA pomocí spektrofotometru Biowave II
  • Pracujeme na ledu a v Biohazard boxu
  • Do 0,2 ml eppendorfek určených pro sekvenaci pipetujeme přečištěnou DNA v množství dle délky PCR produktu (viz tabulka), 3–5 pmol primeru a sterilní vodu do celkového objemu 15 µl.
Templát Množství
Kit 3.1 Kit 1.1
PCR produkty
100–200 bp 1–3 ng 1–3 ng
200–500 bp 3–10 ng 3–10 ng
500–1000 bp 5–20 ng 5–20 ng
1000–2000 bp 10–40 ng 10–40 ng
>2000 bp 20–50 ng 40–100 ng
ssDNA 25–50 ng 50–100 ng
dsDNA 150–300 ng 200–500 ng
  • Množství templátové DNA závisí na naměřené koncentraci (pro každý vzorek podle koncentrace PCR produktu spočítáme kolik µl je potřeba, aby v reakci bylo přítomno např. 20 ng DNA a podle toho upravíme množství vody pro příslušný vzorek).
  • Poklepem na eppendorfku prsty promícháme a krátce stočíme na stolní centrifuze a odneseme do sekvenčního centra v přízemí UMBR AV ČR, kde provedou cyklické sekvenování, přečištění sekvenční reakce a také sekvenční analýzu v 16 –ti kapilárním sekvenátoru.
  • Sekvenční centrum používá 2 sekvenační kity. Standardně používáme k sekvenaci 3.1 Cycle Sequencing Kit. 1.1 Cycle Sequencing Kit je lepší použít pokud je pro nás důležitý počátek sekvence studovaného úseku.

Polymerázová řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction)

Princip

Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem (Nobelova cena za chemii). Jde o jednoduchou metodu zmnožení (amplifikace) určité části DNA in vitro.

Základní uspořádání PCR vyžaduje vytvoření směsi reagencií a následné cyklické střídání teplot této směsi.

Složky PCR (PCR mix)

  • templátová DNA – naše studovaná DNA nebo její část, kterou chceme namnožit (gen, část genu nebo nekódující sekvence)
  • DNA polymeráza – enzym, který buduje nový řetězec DNA podle vzoru templátu
  • PCR pufr – udržuje stabilní pH a obsahuje chemikálie pro optimální aktivitu a stabilitu DNA polymerázy
  • MgCl2 – Mg2+ ionty slouží jako kofaktor DNA polymerázy
  • nukleotidy (dNTP) – směs deoxynukleosid trifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), základních stavebních jednotek DNA
  • primery – oligonukleotidy (krátké úseky jednořetězcové DNA), zpravidla o délce 10–25 bazí párující se s komplementární sekvencí v templátové DNA a sloužící jako počáteční místo replikace DNA, bez kterého by DNA polymeráza nemohla začít syntézu nového řetězce; k extenzi primeru dochází ve směru 5’→3′ nově vznikajícího vlákna.

PCR teplotní program

Cyklické střídání teplot umožňuje přístroj zvaný termocykler.

  • Na počátek cyklu se zařazuje počáteční denaturace (94–98°C, 1-10 min); následuje
  • vlastní cyklus:
    • denaturace (94-98 °C, 20 s–1 min): dvoušroubovice DNA se rozplétá na dva řetězce Pozn.: Pro GC bohaté DNA templáty může být denaturace prodloužena na 3-4 min.
    • nasednutí primerů (annealing) (45-60°C, cca 20-45 s): primery se specificky párují s komplementární oblastí na templátové DNA Teplota nasedání primerů by měla být o 5°C nižší než teplota tání (denaturace), tzv. melting temperature (Tm) primerů. Pro primery kratší než 25 bp se Tm vypočítá podle rovnice: Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
    • syntéza DNA (elongace, extenze) (většinou 72 °C, 1 min) – optimální teplota pro činnost DNA polymerázy; na tvorbu 1 000 bazí je potřeba 1 min
  • Finálním krokem je :
    • konečná elongace (72°C, 5-15 min): dokončení syntézy částečných produktů
    • zchlazení PCR reakce (4-15°C)

Střídáním tří teplot dochází k exponenciálnímu množení požadovaného úseku DNA vymezeného dvojicí použitých primerů. Počet cyklů u běžné PCR se pohybuje od 25 do 40. Výsledkem PCR je pak 225-240 kopií příslušného úseku DNA z každé molekuly templátové DNA. DNA lze vizualizovat po inkorporaci UV fluorescenčního barviva (např. Syber Green, ethidiumbromid ) do dvoušroubovice DNA pod UV světlem.

Optimalizace PCR

Cílem optimalizace je specifický průběh PCR reakce, tj. aby vznikal pouze jediný produkt odpovídající amplifikovanému úseku. Výsledek PCR reakce proto ověřujeme na gelu. V případě, že produkt PCR reakce není zřetelný nebo je výsledkem více produktů odlišné délky (nespecifické produkty), reakce neproběhla optimálně. Je nutné změnit reakční podmínky tak, aby PCR proběhla úspěšně. Je několik možností:

  • změna koncentrace DNA – snížením koncentrace DNA snížíme i koncentraci případných inhibitorů PCR, které mohou být přítomny ve vzorku, PCR může úspěšně proběhnout i s množstvím DNA menším než 1 ng; někdy naopak pomůže zvýšit koncentraci DNA až na 50 ng
  • změna teploty nasednutí primeru (annealingu) – snížením umožníme lepší vazbu primerů na templátovou DNA, přílišné snížení však může vést k tvorbě nespecifických produktů. Ideální je provést gradientový pokus a následně vybrat nejvhodnější teplotu.
  • zvýšení koncentrace MgCl2 – hořčík stabilizuje komplex DNA–polymeráza, zvýšení koncentrace na 2.5 – 6.0 mM (standardní koncentrace je 1.5-2.0 mM) může přinést úspěch
  • přidání aditiv – některé látky (DMSO, formamid, betaine, glycerol, BSA, (NH4)2SO4) mohou zvyšovat stabilitu polymerázy, specifičnost vazby primerů
  • modifikace cyklu – prodloužení (zkrácení) doby elongace, zvýšení počtu cyklů, apod.
  • touch-down protokol – do teplotního programu se na počátek amplifikace zařadí 3–5 cyklů s vyšší teplotou nasedání primerů. V prvních cyklech vzniká určité minimum jen specifických produktů, tím se redukuje nespecifické nasedání primeru a snižuje se tvorba nespecifických produktů. V dalších cyklech se použije nižší teplota, která zajistí dostatečný výtěžek.
  • úprava tzv. ramping time (rychlosti přechodu z jedné teploty na druhou) – např. AFLP vyžaduje pomalé ohřívání vzorku (při rychlém zahřívání část primerů odpadne), pro dostatečný výtěžek je nutné snížit ramping time na 1°C/s (standardně bývá 3°C/s).

PCR protokol s využitím Plain PP Master Mixu (Top-Bio)

Plain PP Master Mix již obsahuje PCR pufr, hořčík, nukleotidy a DNA polymerázu. Jeho použitím se výrazně snižuje čas nutný pro přípravu PCR reakce. Snížením počtu pipetovacích kroků je eliminována chybovost při přípravě.
Postup

  • Po celou dobu pracujeme na ledu. Všechny potřebné reagencie necháme rozmrznout. Mezitím si označíme PCR zkumavky nebo stripy.
  • Do 1.5 ml eppendorfky připravíme PCR směs pro příslušný počet vzorků + 1 vzorek (rezerva pro pipetovací chybu). Např. máme 10 vzorků, PCR směs připravíme pro 11 vzorků.
  • Jednotlivé složky pipetujeme v pořadí: voda, primery a Plain PP Master Mix. Promícháme na vortexu a krátce stočíme na stolní centrifuze.
  • Příprava PCR směsi pro jeden vzorek:
reagencie objem (µl) výsledná
koncentrace
sterilní Milli-Q voda 9,5
2 × Plain PP Master Mix 12,5 1 ×
5′ primer 1 0,1-1µM
3′ primer 1 0,1-1µM

Plain PP Master Mix ve finální koncentraci obsahuje 75mM Tris/HCl, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4; 0,01% Tween20; 2,5mM MgCl2; 200µM dATP, 200µM dCTP, 200µM dTTP, 200µM dGTP; 1,25 U Taq DNA polymerázy.

 

  • Příslušný objem PCR směsi (v tomto případě 24 µl) rozpipetujeme do jednotlivých 0,2 ml PCR zkumavek a přidáme 1 µl DNA. Promícháme, krátce stočíme v centrifuze.
  • Zkumavky vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.
  • Po proběhnuté reakci smísíme cca 5 µl DNA s 2 µl LB pufru a otestujeme amplifikovaný produkt nanesením směsi na 1,5% agarosový gel v TBE pufru. Jako standard naneseme 6 µl 100bp ladderu firmy NEB.

 

OBECNÉ INFORMACE O AZERBÁJDŽÁNSKÉM HOSPODÁŘSTVÍ

Po obnovení nezávislosti v roce 1991 začala Ázerbájdžánská republika vykonávat svrchovaná práva a provádět nezávislou politiku v hospodářské oblasti. Hlavními směry této politiky byl ekonomický systém vytvořený na základě různých forem vlastnictví, přechodu k tržní ekonomice a integrace do světové ekonomiky.

OBECNÉ INFORMACE O AZERBÁJDŽÁNSKÉM HOSPODÁŘSTVÍ
OBECNÉ INFORMACE O AZERBÁJDŽÁNSKÉM HOSPODÁŘSTVÍ

Oděvní výroba v Ázerbájdžánu se zvýšila o 32%

Současný ekonomický vývoj země od získání nezávislosti lze rozdělit do dvou hlavních fází: zaprvé, období ekonomického chaosu nebo recese, zahrnující roky 1991-1995; zadruhé, období makroekonomické stability a dynamického ekonomického rozvoje, které začalo v roce 1996.

OBECNÉ INFORMACE O AZERBÁJDŽÁNSKÉM HOSPODÁŘSTVÍ
OBECNÉ INFORMACE O AZERBÁJDŽÁNSKÉM HOSPODÁŘSTVÍ

Během krátkého historického období od obnovení státní nezávislosti došlo v důsledku prozíravé politiky a tvrdé práce národního vůdce ázerbájdžánského lidu Hejdara Alijeva k velkým úspěchům v oblasti sociálně-ekonomického rozvoje a integrace do světové ekonomiky. Největším úspěchem je, že v procesu budování samostatného státu v naší zemi se v tomto období objevil zásadně nový model ekonomické reformy a rozvoje – ázerbájdžánský model.

Průměrný plat v regionu Yasamal v Ázerbájdžánu dosahuje 700 manatů

Exportní ropovody Baku – Novorossijsk a Baku – Supsa byly uvedeny do provozu v roce 1996 a hlavní exportní ropovod Baku – Tbilisi – Ceyhan byl podepsán v roce 1999, aby přinesl ázerbájdžánskou ropu na světové trhy, a diverzifikoval tak exportní trasy.

rozvoje ropných polí
rozvoje ropných polí

Vyhláška podepsaná naším národním vůdcem Hejdarem Alijevem v roce 1999 stanoví efektivní správu výnosů z prodeje ropy ze společného rozvoje ropných polí se zahraničními společnostmi, využití těchto prostředků na rozvoj prioritních oblastí a provádění sociálně-ekonomicky významných projektů. Byl založen ropný fond. V současnosti jsou aktivity nadace a zajišťování transparentnosti v této oblasti mezinárodními organizacemi vysoce ceněny.

Ropný a plynárenský sektor hrál lokomotivní roli v rozvoji ostatních hospodářských odvětví. Díky dobře promyšlené hospodářské politice byla dosažena makroekonomická stabilita a byl položen základ pro udržitelný hospodářský růst, byly zahájeny reformy ve všech hospodářských odvětvích a byly podniknuty vážné kroky ke zlepšení životní úrovně obyvatelstva.

Jedním z charakteristických rysů hospodářské politiky sledované v této fázi byl rozvoj podnikání, přitahování domácích a zahraničních investic vytvářením příznivého obchodního a investičního prostředí a rozvoj neropného sektoru. V důsledku přijatých účelných opatření se v Ázerbájdžánu vytvořila třída podnikatelů a zvýšila se role soukromého sektoru v sociálně-ekonomickém rozvoji země.

vůdce Ázerbájdžánské republiky Hejdar Alijev
vůdce Ázerbájdžánské republiky Hejdar Alijev

Opatření přijatá k zajištění rozmanitosti majetku v hospodářství měla pozitivní dopad na udržitelný hospodářský rozvoj. Když tedy začala privatizace, byl podíl soukromého sektoru na HDP ve skutečnosti méně než 10%, nyní však jeho podíl dosáhl 83%.

Po získání státní nezávislosti byly jedním z důležitých směrů zahraniční hospodářské politiky Ázerbájdžánské republiky vztahy s mezinárodními finančními a úvěrovými a ekonomickými organizacemi. V uplynulém období bylo v této oblasti vykonáno mnoho práce. Ázerbajdžán se stal členem téměř všech vlivných mezinárodních organizací, včetně Mezinárodního měnového fondu v roce 1992, Světové banky, Evropské banky pro obnovu a rozvoj, Islámské rozvojové banky a Asijské rozvojové banky v roce 1999.

Azerbaijan Airlines
Azerbaijan Airlines

Strategickými cíli sociálně-ekonomické politiky úspěšně sledovanými prezidentem Ázerbájdžánské republiky Ilhamem Alijevem a obohacené o nové odstíny je vytvoření sociálně orientované, diverzifikované národní ekonomiky s volnými tržními vztahy a vlastním rozvojem a integrací do světového ekonomického systému.

Khazar auto
Khazar auto

Úspěchy dosažené v důsledku této politiky založené na logice udržitelného a dynamického rozvoje byly dále posilovány, byla udržována makroekonomická stabilita, byla zrychlena ekonomická diverzifikace, rozvoj neropných odvětví a regionů, bylo zajištěno efektivní využívání strategických devizových rezerv. zvýšila se spolehlivost, zavedla se konzervativní zahraniční výpůjční strategie, posílila se státní podpora podnikání a trvale se zlepšovalo sociální zabezpečení obyvatelstva.

V souladu s nařízením prezidenta Ázerbájdžánské republiky ze dne 16. března 2016 č. 1897 „Po schválení hlavních směrů strategického plánu pro národní hospodářství a klíčová odvětví hospodářství“ bylo celkem 11 strategických plánů pro 11 sektorů národního hospodářství a hospodářství rozvinutý. Strategický plán pro národní ekonomický výhled zahrnuje krátkodobé, střednědobé a dlouhodobé výhledy, strategii a akční plán hospodářského rozvoje do roku 2020, dlouhodobou vizi do roku 2025 a cílovou vizi na období po roce 2025. Dokument poskytuje nejen rozvojové cíle a principy, ale také globální trendy v každé oblasti, 360stupňovou diagnostiku ekonomiky a analýzu současné situace na GZIT, opatření, která je třeba přijmout, požadované investice a ukazatele výsledků. Strategický plán poskytuje příležitosti pro komunikaci a spolupráci mezi všemi faktory přispívajícími k hospodářskému rozvoji, včetně zástupců místního a mezinárodního soukromého sektoru. Podle plánu jsou veřejné investice katalyzátorem a lokomotivou hospodářského rozvoje je soukromý sektor. Je třeba poznamenat, že po přijetí strategického plánu příslušné vládní agentury postavily své aktivity na základě podrobnějších programů pro jeho provádění. Studie proveditelnosti se provádějí před realizací projektů předpokládaných v dokumentu a za každou iniciativu jsou odpovědné příslušné vládní agentury. Strategický plán poskytuje příležitosti pro komunikaci a spolupráci mezi všemi faktory přispívajícími k hospodářskému rozvoji, včetně zástupců místního a mezinárodního soukromého sektoru. Podle plánu jsou veřejné investice katalyzátorem a lokomotivou hospodářského rozvoje je soukromý sektor. Je třeba poznamenat, že po přijetí strategického plánu příslušné vládní agentury postavily své aktivity na základě podrobnějších programů pro jeho provádění. Studie proveditelnosti se provádějí před realizací projektů předpokládaných v dokumentu a za každou iniciativu jsou odpovědné příslušné vládní agentury. Strategický plán poskytuje příležitosti pro komunikaci a spolupráci mezi všemi faktory přispívajícími k hospodářskému rozvoji, včetně zástupců místního a mezinárodního soukromého sektoru. Podle plánu jsou veřejné investice katalyzátorem a lokomotivou hospodářského rozvoje je soukromý sektor. Je třeba poznamenat, že po přijetí strategického plánu příslušné vládní agentury postavily své aktivity na základě podrobnějších programů pro jeho provádění. Studie proveditelnosti se provádějí před realizací projektů předpokládaných v dokumentu a za každou iniciativu jsou odpovědné příslušné vládní agentury. Podle plánu jsou veřejné investice katalyzátorem a lokomotivou hospodářského rozvoje je soukromý sektor. Je třeba poznamenat, že po přijetí strategického plánu příslušné vládní agentury postavily své aktivity na základě podrobnějších programů pro jeho provádění. Studie proveditelnosti se provádějí před realizací projektů předpokládaných v dokumentu a za každou iniciativu jsou odpovědné příslušné vládní agentury. Podle plánu jsou veřejné investice katalyzátorem a lokomotivou hospodářského rozvoje je soukromý sektor. Je třeba poznamenat, že po přijetí strategického plánu příslušné vládní agentury postavily své aktivity na základě podrobnějších programů pro jeho provádění. Studie proveditelnosti se provádějí před realizací projektů předpokládaných v dokumentu a za každou iniciativu jsou odpovědné příslušné vládní agentury.

Pro systematické a důsledné provádění opatření předpokládaných v souvislosti s diverzifikací ekonomiky byly příslušnými dekrety a nařízeními prezidenta provedeny v letech 2004-2018 3 pětileté programy sociálně-ekonomického rozvoje regionů Ázerbájdžánské republiky.

ulice Nizami ve městě Baku
ulice Nizami ve městě Baku

Realizace úkolů předpokládaných ve státních programech přijatých a úspěšně realizovaných v oblasti regionálního rozvoje, jakož i nařízení o dalších opatřeních pro sociálně-ekonomický rozvoj regionů přispějí k udržitelnému rozvoji neropného sektoru, ke zlepšení kvality veřejných služeb a sociální infrastruktury v regionech. stimuloval růst investic, vytváření nových podniků, pracovních míst a v důsledku toho zvyšoval zaměstnanost a snižoval chudobu. V období provádění státních programů v letech 2004–2018 se hrubý domácí produkt zvýšil 3,3krát, z toho v ropném sektoru 2,8krát, v průmyslu 2,6krát a v zemědělství 1,7krát. V důsledku cílených opatření přijatých v tomto období byly v zemi vytvořeny více než 2 miliony nových pracovních míst a více než 100 000 podniků, z nichž 1,5 milionu bylo trvalých, nezaměstnanost klesla o 5 procent a chudoba o 5,1 procenta. Rozsáhlá práce prováděná v rámci státních programů položila pevný základ pro rozvoj regionů v příštích letech.

S cílem pokračovat v práci v oblasti sociálně-ekonomického rozvoje regionů země, včetně venkovských oblastí, v příštích letech a dále zlepšovat infrastrukturu a sociální služby, zvyšovat zaměstnanost a materiální blahobyt obyvatel žijících v regionech. Státní program sociálně-ekonomického rozvoje v nadcházejících letech “úspěšně pokračuje.

Ázerbajdžán dnes vytvořil kvalitativně nový ekonomický model, rozšířil politické a obchodní vztahy mezi Evropou a Asií a spolu s rozvojem kavkazského dopravního koridoru hraje důležitou roli při provádění velkých projektů. V posledních letech se v důsledku realizace mezinárodních nadnárodních projektů iniciovaných a účastněných Ázerbájdžánem stala naše země mezinárodním dopravním koridorem, dopravním uzlem. U nás byla postavena velká loděnice. Uvedení největšího mezinárodního obchodního přístavu v Alatském moři a železnice Baku-Tbilisi-Kars v Kaspické pánvi je historická událost.

Vyrobeno v Ázerbájdžánu
Vyrobeno v Ázerbájdžánu

5. října 2016 podepsal prezident Ázerbájdžánské republiky pan Ilham Alijev dekret o rozsáhlé podpoře místních ropných produktů na zahraničních trzích pod názvem „Vyrobeno v Ázerbájdžánu“. Tato vyhláška se vztahuje na 9 různých mechanismů – podpůrná opatření k propagaci značky „Made in Azerbaijan“ v zahraničí a stimulaci vývozu. V současné době se pod značkou „Made in Azerbaijan“ vyváží více než 3 000 produktů.

Počet obchodních domů v zahraničí roste s cílem podpořit export konkurenceschopných produktů naší země. V současné době probíhají organizační práce na posílení jejich činnosti.

Strategie udržitelného rozvoje sledovaná v Ázerbájdžánu je vysoce ceněna také mezinárodními organizacemi a ekonomickými organizacemi. V další zprávě Doing Business 2020 zveřejněné Světovou bankou a Mezinárodní finanční korporací byl Ázerbájdžán zařazen na seznam 20 nejvíce reformních zemí na světě a prohlášen za jednu z nejvíce reformních zemí na světě.

MAAG CZ, s.r.o. IČO: 26928884

Datum vzniku a zápisu: 12. května 2004
Spisová značka: C 46186 vedená u Krajského soudu v Brně
Obchodní firma: MAAG CZ, s.r.o.

MAAG CZ, s.r.o. IČO: 26928884
MAAG CZ, s.r.o. IČO: 26928884

Sídlo: Vídeňská 262/125c, Přízřenice, 619 00 Brno
Identifikační číslo: 26928884
Právní forma: Společnost s ručením omezeným
Předmět podnikání: zednictví
výroba, obchod a služby neuvedené v přílohách 1 až 3 živnostenského zákona
Statutární orgán:
jednatel:

Ing. MARTIN MICHALKO, dat. nar. 6. srpna 1966
82104 Bratislava, Jakabova, Slovenská republika
Den vzniku funkce: 21. října 2015
Způsob jednání:
Způsob jednání za společnost: Jménem společnosti jedná a podepisuje jednatel.
Společníci:
Společník:
Ing. MARTIN MICHALKO, dat. nar. 6. srpna 1966
82104 Bratislava, Jakabova 3619/43, Slovenská republika

Podíl:
Vklad: 200 000,- Kč
Splaceno: 200 000,- Kč
Obchodní podíl: 100%
Druh podílu: základní
Kmenový list: nebyl vydán
Základní kapitál:
200 000,- Kč
Ostatní skutečnosti:
Počet členů statutárního orgánu: 1

Sultrade Praha, spol. s r.o. CZ61456152

SULTRADE Praha, spol. s r.o.
IČO: 61456152
Z. KAPITÁL: 2.7 miliony Kč
SCHRÁNKA: ija5cef
DIČ (DPH): CZ61456152, Detail plátce DPH
ADRESA: Bělohorská 238/85, Břevnov (Praha 6), 169 00 Praha

Sultrade Praha, spol. s r.o. CZ61456152
Sultrade Praha, spol. s r.o. CZ61456152

Datum vzniku a zápisu 30. březen 1994
Spisová značka C 27768/MSPH Městský soud v Praze
Obchodní firma SULTRADE Praha, spol. s r.o.
Sídlo Bělohorská 238/85, 169 00 Praha
Identifikační číslo 61456152
Právní forma Společnost s r.o.
Předmět podnikání obstaravatelská činnost v oblasti obchodu
koupě zboží za účelem jeho dalšího prodeje a prodej (vyjma činností uvedených v příl.2 a 3 zák.č.455/91 sb.)
engineering v oblasti farmacie, chemické výroby a technologie
činnost účetních poradců, vedení účetnictví
výroba kovových konstrukcí, kotlů, těles a kontejnerů
výroba strojů a zařízení pro využití mechanické energie
montáž, opravy, revize a zkoušky elektrických zařízení
montáž, opravy, revize a zkoušky plynových zařízení a plnění nádob plyny
montáž, opravy, revize a zkoušky tlakových zařízení a nádob na plyny
Statutární orgán
Jednatel
Vladimír Klápa
okres Benešov
Den vzniku funkce: 1. duben 2013
Jednatel
Ing. Petr Kostadinov
Hostivice
Den vzniku funkce: 30. březen 1994
Způsob jednání
Způsob jednání jménem společnosti: Společnost je zastupována a za ni se podepisuje ve všech věcech jednatel, a to samostatně.
Společníci
Společník
Ing. Petr Kostadinov
Hostivice
Podíl: Vklad: 2 739 000,-Kč
Splaceno: 100.00%
Obchodní podíl: 100.00 %
Základní kapitál 2 739 000,-Kč

Téměř 9 000 nakažených ve Francii, nárůst úmrtí ve Španělsku a České republice s nejvyšší mírou nakažených

Ve Francii bylo v pátek zaznamenáno téměř 9 000 nakažených koronavirem – dosud největší počet nově nakažených. Za posledních 24 hodin byl nejvyšší počet infekcí zjištěn také ve Španělsku. Převládajícími regiony z hlediska počtu nových infekcí v Portugalsku jsou aglomerace kapitálu a severní okresy země. V Německu došlo k dobrému nárůstu infekcí a v České republice je nyní nejvyšší míra infekcí v regionu.

nárůst úmrtí ve Španělsku a České republice
nárůst úmrtí ve Španělsku a České republice

Francouzské ministerstvo zdravotnictví v pátek uvedlo, že za posledních 24 hodin bylo zjištěno 8 975 infekcí koronaviry. Jedná se o nejvyšší denní nárůst v této zemi od začátku pandemie. Většina případů byla dosud zjištěna 31. března, kdy bylo koronavirem infikováno 7 578 lidí. Ve Francii bylo dosud hlášeno 309 156 infekcí.

Celkový počet obětí byl revidován směrem dolů o 20 v důsledku revize údajů ze sociálních a lékařsko-sociálních služeb. Podle nejnovější zprávy COVID-19 v zemi dosud zemřelo 30 686 lidí.

Počet lidí léčených na jednotkách intenzivní péče za posledních šest dní rostl a ve čtvrtek dorazilo devět pacientů. Celkově je na JIP 473 pacientů s COVID-19 a v nemocnicích je ošetřeno celkem 4 671 lidí. Stále čtyři regiony – Ile-de-France, Grand Est, Auvergne-Rhône-Alpes a Hauts-de-France – tvoří více než 67 procent. případy hospitalizace pacientů s COVID-19 ve Francii.

Nejvyšší denní počet infekcí ve Španělsku

Podle zdravotnického oddělení pod vedením Salvadora Ily se od čtvrtka do pátku zvýšil počet infekcí SARS-CoV-2 o 10 476 případů a celkový počet infekcí je již 498 989. Je to také nejvyšší nárůst počtu dosud zaznamenaných infekcí.

Ministerstvo zdravotnictví upřesnilo, že největší počet případů koronavirové infekce se v současné době vyskytuje v autonomní komunitě v Madridu. Četné případy COVID-19 potvrdily v pátek odpoledne také lékařské orgány madridské komunity, což naznačuje, že za posledních 24 hodin bylo zaznamenáno 2 254 případů infekcí a 20 úmrtí.

Španělské ministerstvo zdravotnictví mezitím poukázalo na drastický nárůst úmrtí za posledních 24 hodin. Bylo zjištěno, že zatímco mezi středou a čtvrtkem jich bylo 40, během následujícího dne jich bylo až 184. Španělské ministerstvo zdravotnictví odhaduje, že do pátečního večera zemřelo na celonárodní následky 29 418 lidí v důsledku infekce SARS-CoV-2.

Četné infekce v lisabonské aglomeraci

Poslední den přinesl malou změnu v Portugalsku, kde se od čtvrtka do pátku zvýšil počet úmrtí na COVID-19 o čtyři na 1833. V páteční tiskové zprávě portugalské ministerstvo zdravotnictví uvedlo, že za posledních 24 hodin bylo zaznamenáno 406 nových pacientů se SARS-CoV-2.

Bylo také připomenuto, že 418 infekcí koronaviry bylo potvrzeno o den dříve. Celkový počet případů infekce v této zemi je již 59 457. Stále převládajícími regiony, pokud jde o počet nových infekcí v Portugalsku, jsou hlavní aglomerace a severní okresy země.

Značný nárůst infekcí v Německu

V sobotu Ústav infekčních nemocí Robert Koch (RKI) uvedl, že počet nových potvrzených případů koronaviru v Německu za poslední den činil 1378, což zvýšilo jejich celkový počet na 248 997. Počet nových infekcí je vyšší než předchozí den, kdy činil 782 případů.

Dva lidé zemřeli současně. Celkový počet obětí v této zemi je nyní 9 324. Přibližně 1 400 infikovaných se zotavilo a nyní se počet lidí v Německu zotavujících se z infekce pohybuje kolem 221 900.

Z německých spolkových zemí byl dosud nejvyšší počet infekcí zjištěn v Severním Porýní-Vestfálsku (přes 59,6 tis.), V Bavorsku (přes 58,2 tis.) A v Bádensku-Württembersku (přes 42,7 tis.) A nejnižší v sousedních zemích Polsko, Mecklenburg-Vorpommern (1019 případů).

Česká republika s nejvyšší mírou infekce v regionu

Za posledních 24 hodin bylo v České republice potvrzeno 798 nových případů SARS-CoV-2. U většiny infikovaných je však onemocnění mírné, méně než 3 procenta infikovaných jsou hospitalizováni, informovalo v sobotu ministerstvo zdravotnictví v Praze.

Celkově vzrostl počet lidí infikovaných koronavirem na 27 250 a 429 pacientů zemřelo. 44 pacientů je léčeno na jednotkách intenzivní péče a 19 429 lidí se uzdravilo.

Agentura ČTK uvádí, že v České republice je v současnosti nejvyšší míra infekce koronaviry v regionu. Podle médií Německo a Slovensko zvažují zařazení České republiky do skupiny nebezpečných zemí kvůli rychlosti šíření epidemie.

Od 1. září musí země nosit masky v kancelářích, zdravotních střediscích a veřejné dopravě. V pátek se pražské orgány rozhodly rozšířit tuto povinnost na obchody a nákupní centra od 9. září. Od 14. září budou studenti a učitelé pražských škol muset nosit masky, kromě studia v učebně.

Nejvyšší počet infekcí je v okrese Hodonín na jižní Moravě, kde bylo do 7 dnů potvrzeno 86 nových případů infekce na 100 000 obyvatel. V Praze je tento ukazatel téměř 55. Zástupci hygienických služeb v hlavním městě připouštějí, že je pro ně stále obtížnější určit zdroj nových infekcí koronaviry.

Od začátku pandemie bylo na celém světě diagnostikováno více než 26,2 milionu infekcí a více než 868 000 úmrtí .

Postupné dávkování represí. Třetí týden politické krize v Bělorusku

Po masové demonstraci pořádané v neděli v centru Minsku (odhaduje se na 100 000–1 500 000 účastníků) se dynamika protestů výrazně snížila. Podobný trend nastal minulý týden po první masové demonstraci 16. srpna.

Postupné dávkování represí. Třetí týden politické krize v Bělorusku
Postupné dávkování represí. Třetí týden politické krize v Bělorusku

V posledních dnech se tradičně konaly protesty v Minsku, Grodně a Brestu, stejně jako v menších městech, jako je Mołodeczno a Żodino. Počet demonstrací nepřesáhl několik tisíc lidí. Na pracovištích stále existují náznaky nespokojenosti, ale žádnému z nich se nepodařilo zorganizovat generální stávku k zastavení výroby. Nejaktivnější byli pracovníci závodu Grodno Azot v Grodně (dusíkatá hnojiva) a závodu Biełaz v Żodzi (výroba stavebních vozidel). Koordinační rada pro Mírovým předáním moci vyzvala občany, aby se hromadně přidali k jejímu složení, a 26. srpna mělo tělo již kolem 2 000 členů. Vedoucí představitelé rady, včetně bývalého ministra kultury a diplomata Pavla Latušky, zároveň zahájili postup (stanovený v běloruském volebním zákoně), který spočívá v odvolání poslanců dolní komory parlamentu. Důvodem je především nedostatečný zásah proti brutálním činům donucovacích orgánů. V současné době byly v tomto směru podniknuty kroky u 20 ze 110 poslanců. zahájila řízení o odvolání poslanců dolní komory parlamentu (stanovené v běloruském volebním zákoně). Důvodem je především nedostatečný zásah proti brutálním činům donucovacích orgánů. V současné době byly v tomto směru podniknuty kroky u 20 ze 110 poslanců. zahájila řízení o odvolání poslanců dolní komory parlamentu (stanovené v běloruském volebním zákoně). Důvodem je především nedostatečný zásah proti brutálním činům donucovacích orgánů. V současné době byly v tomto směru podniknuty kroky u 20 ze 110 poslanců.

Od pondělí úřady zesílily represi vůči nejaktivnějším vůdcům a účastníkům protestů. Zadržen a odsouzen k 10 dnům odnětí svobody, vč. Wolha Kawalekowa, který je členem předsednictva rady, a předsedové stávkových výborů ve dvou varšavských závodech: MTZ (výroba traktorů) a MZKT (výroba zbraní). Vedoucí protestů pracujících v závodě Grodno Azot Yuryj Rawawy se zase uchýlil do Polska a požádal o azyl. Vyšetřovací výbor dále vyzval k výslechům členů předsednictva rady, včetně Pawla Latuszky a nositele Nobelovy ceny Swiatlany Aleksijewiczové.

Za poslední dva dny OMON zadržuje každý den několik desítek účastníků demonstrací, které se konají v centru Minsku. Neexistuje žádná hrubá síla nebo masové uklidnění demonstrantů. Alyaksandr Lukašenka se vrátil k tradičnímu vyprávění o vnějším zásahu (znovu obvinil Varšavu, že chce začlenit oblast Grodno), a obvinění proti demonstrantům byla doplněna populistickou rétorikou, která v posledních týdnech téměř chyběla. 25. srpna na konferenci o hospodářské politice jasně zdůraznil, že bez ohledu na stav státních financí je nutné udržovat současnou úroveň mezd v rozpočtovém sektoru a důchodech, se zvláštním důrazem na výhody veteránů. Aleh Hajdukiewicz, poslanec Sněmovny reprezentantů, kterému důvěřoval Lukašenka, navrhl svolat mimořádné zasedání parlamentu, aby se zákonodárce mohl podílet na regulaci situace v zemi. V posledních dnech výrazně vzrostla poptávka po cizích měnách, zejména po eurech a dolarech, což vedlo k částečnému deficitu směnáren. V důsledku toho kurz běloruského rublu vůči těmto měnám poklesl o více než 5%. Také se zvýšily náklady na servis běloruských eurobondů vydaných v červnu tohoto roku. za 1,25 miliardy dolarů. V důsledku toho kurz běloruského rublu vůči těmto měnám poklesl o více než 5%. Také se zvýšily náklady na servis běloruských eurobondů vydaných v červnu tohoto roku. za 1,25 miliardy dolarů. V důsledku toho kurz běloruského rublu vůči těmto měnám poklesl o více než 5%. Také se zvýšily náklady na servis běloruských eurobondů vydaných v červnu tohoto roku. za 1,25 miliardy dolarů.

Patová situace. Politická krize v Bělorusku

30. srpna se v Minsku konal Pochod za mír a nezávislost, kterého se zúčastnilo nejméně 100 000 lidí. lidé. Byla to již třetí neděle masových demonstrací občanů požadujících rezignaci Aleksandra Lukašenka a pořádání nových, spravedlivých prezidentských voleb.

Patová situace. Politická krize v Bělorusku
Patová situace. Politická krize v Bělorusku

Pochod skončil před prezidentským palácem, chráněným značnými silami. Na konci demonstrace byli demonstranti osloveni Lukašenkovým poradcem Mikalajem Latyszonakem, který vyzval k mírovému vyřešení konfliktu a informoval o práci na nové ústavě. Mnohem menší, v rozmezí od několika set do 10 000. tisíce účastníků, konaly se demonstrace, vč. v Grodnu, Brestu, Mogilevu, Homelu a mnoha menších regionálních městech, včetně Baranowicze, Orsza, Pinsk, Mołodeczno, Lida a Żodina. Všechny demonstrace byly klidné, tentokrát také spojeno s posměšnou oslavou Lukašenkových 66. narozenin. 29. srpna se v Minsku konal pochod solidarity žen za účasti asi 10 000 účastníků. Aktivita demonstrantů ve všední dny byla mnohem slabší – několik tisíc lidí se shromáždilo v centru Minsku.

V posledních dnech se donucovací orgány řídily taktikou postupného dávkování represí a zadržovaly nejaktivnější demonstranty (kromě žen) a novináře. 30. srpna bylo v Minsku zadrženo asi 140 lidí, z nichž někteří budou pravděpodobně potrestáni několikadenním zatčením. OMON se pokusil rozdělit sloupec demonstrantů do několika menších skupin a také blokovat jejich pohyb po centru města. Násilí na zadržených bylo zabráněno a po volbách byly použity gumové projektily, vodní děla, blesky a slzný plyn. Úřady se zároveň pokusily zastrašit demonstranty a shromáždily v Minsku značné síly OMONu i pravidelnou armádu vybavenou bojovými vozidly pěchoty. Demonstranti byli opakovaně varováni před nelegální povahou všech shromáždění. Tisková služba prezidenta navíc znovu zveřejnila jeho fotografii s kalašnikovem.

V posledních dnech Lukašenka pokračoval ve své agresivní protizápadní rétorice. 28. srpna upozornil na koncentraci vojenských sil v Polsku a Litvě, zejména na „převoz z amerického Berlína“ amerického vojenského letectví do Polska, které podle jeho názoru mohlo „nést i jaderné střely“. Rovněž pohrozil zavedením sankcí proti Vilniusu a Varšavě spočívajících v blokování tranzitu zboží přes Bělorusko a přesměrování běloruského vývozu z Klajpedy do dalších pobaltských přístavů (alternativní směry nespecifikoval).

Současně probíhají intenzivní konzultace s Kremlem. Dne 30. srpna vedli představitelé Ruska a Běloruska pátý telefonický rozhovor od začátku politické krize. Vladimir Putin Lukašenkovi vyjádřil přání k narozeninám a pozval ho na návštěvu Moskvy „v příštích týdnech“.

V posledních dnech většina běloruských bank pozastavila poskytování úvěrů fyzickým osobám a snížila půjčky podnikům. Hlavním důvodem je problém s likviditou bankovního sektoru v běloruských rublech, což je zase důsledek masivního stažení úspor občany, kteří kupují eura nebo dolary v reakci na nestabilní politickou situaci.

Protilátky proti COVID-19 jsou v těle přítomny nejméně čtyři měsíce.

Islandští vědci zkoumali, jak dlouho zůstává koncentrace antikoravirových protilátek SARS-CoV-2 v těle po ukončení infekce. Studie zahrnovala více než 30 000 lidí, tj. Téměř 10 procent populace země.

Vědci z několika islandských výzkumných center publikovali výsledky výzkumu koronaviru SARS-CoV-2 mezi Islanďany v The New England Journal of Medicine. Odborníci primárně kontrolovali přítomnost protilátek u více než 30 000 lidí. Tato skupina zahrnovala diagnostikované pacienty s COVID-19, stejně jako lidi v karanténě, kteří byli v kontaktu s virem, a ty, o kterých nebylo známo, že s ním měli kontakt (lze je považovat za průměrné občany).

Protilátky proti COVID-19 jsou v těle přítomny nejméně čtyři měsíce.
Protilátky proti COVID-19 jsou v těle přítomny nejméně čtyři měsíce.

Jak dlouho zůstávají protilátky v těle?

Vědci detekovali protilátky u 91 procent lidí, kterým byl dříve diagnostikován koronavirus. Byli přítomni pouze u 2,3 ​​procenta lidí, kteří byli v karanténě. V poslední skupině „průměrných občanů“ bylo toto procento 0,3 procenta.

Vědci se hlavně zajímali o to, jak dlouho protilátky v těle vydrží. Podle studie jejich úroveň neklesá po dobu nejméně čtyř měsíců.

Vědci odhadli, že koronavirus celkově ovlivnil 0,9 procenta celkové islandské populace. U 0,3 infikovaných se nemoc ukázala jako smrtelná.

Kromě toho zjistili, že 56 procent všech infekcí koronaviry na Islandu bylo detekováno kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (qPCR). 14 procent infikovaných bylo umístěno do karantény, ale nebylo testováno pomocí qPCR nebo v testu neprošlo. Zbývajících 30 procent infikovaných nebylo testováno qPCR ani do karantény.

Co jsou protilátky?

Protilátky jsou buňky, které váš imunitní systém vylučuje. Hrají zásadní roli při obraně těla před bakteriemi, viry, parazity a plísněmi. Protilátky zabraňují opětovnému onemocnění, jako jsou příušnice nebo neštovice.

První super tajfun v roce 2020. Haishen ohrožuje Japonsko a Jižní Koreu

Tajfun Haishen se blíží k Japonsku a Jižní Koreji. Předpovědi počasí varují před silným větrem, vysokými vlnami a silným deštěm. V nárazech fouká rychlostí více než 250 kilometrů za hodinu.

Haishen by mohl být závažnějším tajfunem než Maysak, který ve čtvrtek zasáhl Jižní Koreu, tvrdí meteorologové AccuWeather. Podle Společného varovného centra pro tajfuny je Haishen prvním super tajfunem, který byl vytvořen v roce 2020. Nesou nárazové větry a silné deště.

– Haishen může být zvláště zničující pro jižní oblasti Japonska a Jižní Koreje. Dva tajfuny, oba ekvivalentní silným hurikánům v Atlantiku, zasáhnou téměř stejné místo během týdne, uvedl Jake Sojda, meteorolog z AccuWeather. „Jakoukoli budovu nebo infrastrukturu, která byla dříve oslabena nebo mírně poškozena Maysakem, může Haishen zcela zničit,“ dodal.

Vítr, který doprovází tajfun, fouká rychlostí přes 200 km / ha nárazy přesahují 250 km / h. Prvek se pohybuje na sever rychlostí 30 km / h.

Podle meteorologů jsou nejvíce ohroženy severní regiony ostrovů Rjúkjú, jižní regiony ostrovů Kjúšú a jižní a východní část Jižní Koreje.

První super tajfun v roce 2020. Haishen ohrožuje Japonsko a Jižní Koreu
První super tajfun v roce 2020. Haishen ohrožuje Japonsko a Jižní Koreu

Pozastavená železniční spojení

Japonská meteorologická agentura varuje obyvatele Okinawy a ostrovů Kjúšú, aby byli opatrní a připravili se na úder tajfunu. Aby se zabránilo škodám způsobeným katastrofou, přepravní společnost Kyushu Railway Co uvedla, že pozastaví některá ze svých železničních spojení v neděli a všechna v pondělí.

Haishen je třetím tajfunem, který zasáhl Korejský poloostrov. Dříve se v této oblasti formovaly Maysak a Bavi. Podle meteorologa Roberta Speta, experta na počasí v západním Pacifiku, mohl tajfun Haishen bojovat s hurikánem Laura o titul nejsilnější bouře v roce 2020.

tajfun
tajfun